Polimeraza ĉen-reakcio
Polimeraza ĉen-reakcio, mallongigo PĈR (angle PCR) estas tekniko kiu ebligas amplifi envitre malgrandan kvanton de DNA, por rapide fari milionojn aŭ miliardojn da kopioj. PĈR estis inventita en 1984 de la usona biokemiisto Kary Mullis ĉe la firmao Cetus Corporation. Ĝi estas fundamenta por multe de genetika testado inkluzive de analizo de antikvaj specimenoj de DNA kaj identigo de infektaj agentoj.
La plej multaj PĈR-metodoj dependas de termaj cikloj. Tiuj termaj cikloj ripete varmiĝas kaj malvarmiĝas la reakciilojn, ebligante temperatur-dependaj reakcioj: DNA denaturo, kaj DNA replikiĝo fare de enzimo. La principaj reakciiloj en PĈR estas prajmiloj (mallongaj unufadenaj DNA fragmentoj kiuj estas komplementa al la celita DNA-sinsekvo) kaj DNA-polimerazo. En la unua paŝo de PĈR, la du fadenoj de la DNA estas disigitaj je alta temperaturo. Tiu procezo nomiĝas DNA denaturo. En la dua paŝo, la temperaturo malaltiĝas kaj la prajmiloj ligas al siaj komplementaj DNA-sinsekvoj. La du DNA-fadenoj tiam fariĝas ŝablonojn por DNA-polimerazo, kiu faras novan DNA-fadenon per kunmeto de nukleotidoj (la bazaj eroj de DNA). Dum PĈR progresas, la novfarita DNA estas mem uzata kiel ŝablono por replikiĝo, ekigante reakcion en kiu la originala DNA-ŝablono estas eksponenciale amplifita.
La malkovro de varmoŝatanta eŭbakterio Thermus aquaticus, kiu vivas en varmaj akvo-fontoj (70 ĝis 75 °C) en la nacia usona parko Yellowstone, kaj la posta uzado de ties polimerazo, stabila ĝis temperaturoj proksimaj de 100 °C, estas origino de la disvolviĝo de PĈR. Antaŭ la uzo de tiu varmostabila polimerazo, DNA-polimerazo devis esti aldonita je ĉiun ciklon, kio estis teda kaj multekosta procezo.[1]
Aplikoj de la tekniko inkluzivas DNA klonado por vicrivelado kaj gentekniko; konstruado de DNA-bazitaj filogenioj, aŭ funkcia analizo de genoj; diagnozo kaj monitorado de heredaj malsanoj; amplifo de antikva DNA;[2] analizo de genetikaj fingrospuroj, uzata ekzemple en krimoscienco kaj testado de parenceco; kaj detekto de patogenaj agentoj por la diagnozo de infektaj malsanoj.
Principo
[redakti | redakti fonton]
La envitra amplifa principo baziĝas je ripetado de 3 procezoj:
- denaturo de ambaŭ DNA-fadenoj je alta temperaturo (ĉirkaŭ 95 °C) por disigi DNA-fadenojn kaj ekhavi unufadenajn DNA-molekulojn.
- prajmila komplementa hibridiĝo de unufadena celita DNA-sinsekvo (temperaturo tiam estas ŝanĝita al valoro inter 40 °C kaj 65 °C por ebligi bonan prajmil-fiksiĝon).
- la plilongiga reakcio per termostabila DNA-polimerazo (la Tak-polimerazo) realiĝas je plejefika temperaturo je 72 °C.
La produktaĵoj el tiu unua ciklo estas poste denaturitaj per varmo. Prajmiloj rehibridiĝas kun DNA-fadenoj devenintaj el la unua amplifa ciklo, ĉiu fadeno servas kiel matrico al la polimerazo. Je ĉiu ciklo, la kopi-nombro de la DNA-fragmento duobliĝas: 2n molekuloj haviĝas tiel post n cikloj, t.e. teorie ekzemple 1 048 576 molekuloj post 20 cikloj.
Tiu PĈR-tekniko tute revoluciis la esploradojn en molekula biologia kampo kaj aplikeblas multe tiel en klonado kaj studado de gen-esprimiĝo kiel en serĉado de genetikaj polimorfismoj.
Referencoj
[redakti | redakti fonton]- ↑ (2012) “Determining Annealing Temperatures for Polymerase Chain Reaction”, The American Biology Teacher 74 (4), p. 256–260. doi:10.1525/abt.2012.74.4.9.
- ↑ (2009) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Usono: Wiley, p. 408–410.